O Brasil é o terceiro maior país das Américas, com dimensões continentais e com uma demografia e geografia muito diversa. Realizamos uma constante vigilância genômica dos vírus Influenza, SARS-CoV-2 e DENV circulantes no estado de São Paulo e no país. Os dados obtidos são continuamente enviados aos órgãos de assistência nas três esferas administrativas: municipal, estadual e federal, com o intuito de contribuir de maneira significativa para o direcionamento de ações em políticas públicas. Além disso, a história evolutiva dos vírus detectados pela nossa equipe é analisada e permite estimar, por exemplo, a relação de parentesco (filogenia) entre os genomas, o local e época de origem (datação) de linhagens, e a contabilização de mutações e linhagens por localidade geográfica (rede filogeográfica).
Avaliamos a capacidade neutralizante de soros de indivíduos em diferentes tempos após a
imunização (de Influenza e SARS-CoV-2), contra as variantes detectadas na vigilância
genômica. Utilizamos o ensaio de pseudovírus, um vírus quimérico que compreende o núcleo
estrutural e enzimático de um vírus e pelo menos uma proteína ou glicoproteína de outra,
como por exemplo a proteína Spike do SARS-Cov-2.
Os genomas de RNA são manipulados para codificar um gene marcador quantificável, que é
empacotado por proteínas do núcleo retroviral. A transdução das células alvo pelo pseudovírus
é dependente da capacidade da glicoproteína do envelope de se ligar a receptores na
superfície da célula. Se a entrada for bem-sucedida, o genoma é transferido do vírus para a
célula, resultando na integração e expressão do gene repórter.
Níveis de expressão da proteína marcadora, como por exemplo luciferase, em células
infectadas pode ser subsequentemente medido, o que produz uma leitura quantitativa. Estes
vírus são criados por cotransfecção de plasmídeos em células produtoras, como a HEK293T por
exemplo. Após a transcrição e tradução dos genes, o RNA contendo o gene repórter, como a
luciferase, é empacotado no capsídeo e, posteriormente, as glicoproteínas do vírus a ser
estudado envolvem o capsídeo formando a partícula viral (Figura 2).
Uma vez formado, o pseudovírus transita para a membrana plasmática da célula produtora e é
liberado extracelularmente. Este processo resulta em um sobrenadante de meio de cultura
rico em pseudovírus, que pode ser colhido e titulado na célula alvo que expressa o receptor
para sua glicoproteína do vírus de interesse. A neutralização é quantificada incubando o
pseudovírus com o antissoro dos pacientes e a eficácia do antissoro é medida como a
diminuição na expressão do gene repórter em comparação com o título de transdução do
pseudovírus original (Carnell et al. 2015).
Em estudos de vacinas, grandes volumes de soro são necessários para testes que empregam
vírus selvagem, enquanto que nos testes utilizando os pseudovírus, devido a sensibilidade
produzida pela proteína repórter, a quantidade de amostra é muito baixa, ampliando, dessa
forma, drasticamente o escopo dos laboratórios capacitados a avaliar com eficácia o potencial
de neutralização de antissoros.
Um fator muito importante a ser considerado no monitoramento da efetividade da vacinação
da população é a estabilidade dos anticorpos. A avaliação da reposta após diferentes tempos
da imunização ou infecção é necessária para a correta avaliação da memória imune.
Atualmente, metodologias baseadas em ELISA que avaliam a presença de IgGs são utilizadas
como teste padrão. Propomos utilizar uma nova metodologia baseada em espectrometria de
massas que avalia especificamente os CDRs (Complementarity Determining Region) dos
anticorpos circulantes para identificar aqueles CDRs correspondentes à resposta humoral aos
vírus e, então, analisar diferentes plasmas de diferentes indivíduos com fins de quantificação
de anticorpos (via quantificação de CDRs), em diferentes tempos após vacinação, para que a
estabilidade dos anticorpos seja avaliada.
A caracterização do perfil de imunidade humoral e celular é fundamental para a análise de
proteção de infecção e reinfecção, desenvolvimento de vacinas contra patógenos que
apresentam variabilidade antigênica, controle de situações pandêmicas, potencialização da
resposta imune e estudos de potencial vacinal em idosos e crianças.
Portanto, considerando que a resposta de células TCD4+ e TCD8+ efetoras e de memória
exerce papel importante na proteção contra reinfecção, pretendemos criar um banco de soros
e células sanguíneas de indivíduos vacinados e, então, analisar o padrão de resposta de
indivíduos vacinados, frente às variantes dos vírus de Influenza e SARS-CoV-2, como um
indicativo de eficiência do processo vacinal.
Este centro de estudos avaliará a efetividade das vacinas para Influenza e Covid-19, sob
condições de vida real e questões como a efetividade, de acordo com diferenças
sociodemográficas, de saúde e ambiental, número de doses necessárias por faixa etária e
duração da proteção, e avaliação do estado imunológico.
